Fusión intergénica de protoplastos de Saccharomyces cerevisiae y Hanseniaspora guillermondii / Intergenic fusion of Saccharomyces cerevisiae and Hanseniaspora guillermondii protoplasts

La fusión de protoplastos ha facilitado la obtención de nuevas cepas de levaduras con propiedades biotecnológicas muy interesantes. El principal objetivo de esta investigación fue obtener una levadura híbrida intergénica con potencialidades enológicas características de dos géneros diferentes. Para ello se fusionaron protoplastos de Saccharomyces cerevisiae autóctona de la región zuliana con Hanseniaspora guillermondii CECT 11102 de origen comercial. Saccharomyces es una levadura que produce altas concentraciones de etanol pero el perfil aromático es sencillo y común. Hanseniaspora no resiste las concentraciones de etanol, pero puede generar aromas agradables e intensos. La identificación de las levaduras antes y después de la fusión de protoplastos se realizó con la técnica PCR-RFLP del gen 5.8S rADN y las regiones intergénicas adyacentes ITS1 e ITS2 del ADN extraído, sometiendo los productos amplificados a un análisis de restricción con las enzimas HinfI, HaeIII, CfoI y DdeI. El polietilenglicol fue usado para inducir la fusión de protoplastos. La cepa híbrida presentó características de ambas levaduras parentales debido a que resistió altas concentraciones de etanol como S. cerevisiae y fue capaz de metabolizar el salicín como H. guillermondii. El análisis molecular PCR-RFLP de la levadura híbrida mostró un patrón de bandas diferente al de las levaduras parentales.

Protoplast fusion has facilitated the development of new yeast strains with very interesting biotechnological properties. The main objective of this research was to obtain hybrid yeast with potentialities of two different genera, that could be used in the wine manufacture. Saccharomyces cerevisiae protoplasts from the Zulian region were fused with Hanseniaspora guillermondii CECT 11102 of commercial origin. Saccharomyces is a yeast that produces high levels of ethanol but the aromatic profile is simple and common. Hanseniaspora does not withstand ethanol concentrations, but it can generate pleasant and intense aromas. Identification of yeast before and after the fusion of protoplasts was performed using the PCR-RFLP technique of the 5.8S rDNA gene and the adjacent ITS1 and ITS2 intergenic regions of the extracted DNA, subjecting the amplified products to a restriction with the enzymes HinfI, HaeIII, CfoI and DdeI. Polyethylene glycol was used to induce fusion of protoplasts. The hybrid strain showed characteristics of both parental yeasts because it resisted high concentrations of ethanol as S. cerevisiae and was able to metabolize the salicin as H. guillermondii. PCR-RFLP molecular analysis of hybrid yeast showed a different band pattern than those pertaining to parental yeasts.

Efecto de la concentración de lactosa sobre la producción de β-D-galactosidasa a partir de Kluyveromyces marxianus ATCC 8554 en cultivo por lote alimentado / Effect of lactose concentration over β-D-galactosidase production by Kluyveromyces marxianus ATCC 8554 in fed batch cultures

Se estudió el efecto de la concentración de lactosa sobre la producción de β-D-galactosidasa, a partir de Kluyveromyces marxianus var. marxianus ATCC 8554 en cultivo por lote alimentado, utilizando suero de leche como sustrato. Los bioprocesos se llevaron a cabo por triplicado a dos concentraciones de lactosa: 2,3% y 4,7%, pH 5 y temperatura de 35 ºC en un biorreactor Bioflo 4000. La extracción de la enzima de las células se realizó empleando tolueno al 2%. La actividad enzimática se determinó evaluando la hidrólisis del o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG). En el cultivo por lote alimentado y suero de leche sin diluir (4,7% de lactosa) se logró obtener una alta densidad celular. Sin embargo, con el suero de leche diluido (2,3% de lactosa) se obtuvo un rendimiento superior en biomasa (YX/S). El cultivo por lote alimentado permitió prolongar la fase de producción de la enzima y mantener la producción (509 µmol/L/10 min) por un período de tiempo superior al referenciado en el cultivo por carga.

The effect of lactose concentration over β-D-galactosidase production by Kluyveromyces marxianus ATCC 8554 in fed batch cultures was studied using milk serum as substrate. The bioprocesses were carried out in triplicate at two lactose concentrations: 2.3% and 4.7%, pH 5 and a 35oC temperature in a Bioflo 4000 bioreactor. The enzyme extraction from the cells was done using 2% toluene. Enzymatic activity was determined evaluating the hydrolysis of o-nitrophenil-β-D-galactopiranoside (ONPG). With fed batch cultures and undiluted milk serum (4.7% lactose) we were able to obtain a higher biomass yield (Yx/s). The fed batch cultures allowed prolonging the production phase of the enzyme (509 µmol/L/10min) and maintain production for a longer period of time, higher than that mentioned for load cultures.

Perfil de aminoácidos de la proteína unicelular de Kluyveromyces marxianus var. marxianus / Amino acids profile of the single cell protein from Kluyveromyces marxianus var. marxianus

Se estudió el perfil de aminoácidos de la proteína unicelular (PUC) de la levadura Kluyveromyces marxianus var. marxianus (ATCC 8554) utilizando lactosuero como sustrato. Los bioprocesos se llevaron a cabo por triplicado a pH 5,0; 30°C y 200rpm durante 12h en un biorreactor Bioflo® 4000. Se caracterizó la humedad, lípidos y proteína cruda de la biomasa obtenida. Para el análisis del perfil de aminoácidos se utilizó un cromatógrafo líquido de alta resolución. La derivatización de los aminoácidos libres se realizó con fenilisotiocianato. Los resultados indicaron que el contenido de proteína cruda en K. marxianus es de 42,19 por ciento. El contenido de lisina (5,47 ±3,0 por ciento) y de treonina (15,21 ±2,6 por ciento) en esta proteína son mayores que en la proteína de la harina de trigo. El aminoácido encontrado en mayor cantidad es el ácido glutámico, característico de organismos unicelulares, mientras que la metionina es el aminoácido obtenido en menor proporción. El perfil de aminoácidos muestra una distribución equilibrada del contenido de éstos en la proteína unicelular de K. marxianus en comparación a los patrones de referencia internacionales de la FAO, lo que sugiere el uso potencial de esta proteína unicelular como fuente proteica.

Producción de ácido láctico a partir de suero de leche: utilizando lactobacillus helveticus en cultivo continuo / Production of lactic acid from milk whey: using lactobacillus helveticus in continuous culture

Se estudió el cultivo continuo de la bacteria Lactobacillus helveticus ATCC 8018 en suero de leche desproteinizado y suplementado con 20 g/L de extrato de levadura y 10 g/L de peptona trípsica de caseína, como una función de la tasa de dilución, (D) a pH 5,9 y temperatura de 40°C, condiciones adecuadas de crecimiento del microorganismo previamente determinadas en cultivo por carga. Se utilizó un biorreactor BioFlo 4000 con un volumen de trabajo de 4 L y controles automáticos de los flujos de alimentación, extracción, temperatura, pH y velocidad de agitación. La tasa de dilución se varió entre 0,05 y 0,4 -¹. Se caracterizó el suero de leche, determinando su contenido de lactosa, nitrógeno, proteínas, fósforo y pH. A partir del cultivo continuo se determinó el valor de la tasa específica de crecimiento máximo, (µmax= 0,469 ± 0,012 h-¹), la constante específica de consumo de sustrato, (Ks= 0,064 ± 0,004 Kg/m³), y el rendimiento real (Yc= 0,759 ± 0,061 kg de biomasa producido/kg de lactosa consumido para crecimiento). La máxima concentración de biomasa y ácido láctico fue de 55 y 10,97 kg/m³ respectivamente y se alcanzaron a D= 0,1 h-¹. La máxima productividad de biomasa y ácido láctico fue 6,2 y 1,83 kg/m³.h respectivamente a D= 0,2 h-¹. Estos resultados revelan y sugieren el potencial uso de lactosuero como sustrato para bacterias homolácticas